GB/T 18872-2017 饲料中维生素K3的测定 高效液相色谱法 检测标准

1 范围

本标准规定了饲料中维生素K3(亚硫酸氢钠甲萘醌、亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌、二甲基嘧啶醇亚硫酸甲萘醌，以甲萘醌计)含量测定的高效液相色谱方法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和精料补充料中维生素K3的测定。方法的定量限为0.4mg/kg。

2 规范性引用文件

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GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 14699.1 饲料采样

GB/T 20195 动物饲料 试样的制备

3 原理

试样经三氯甲烷和碳酸钠溶液提取并转化成游离甲萘醌，经反相C18柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。

4 试剂和材料

除另有说明外，本标准所有试剂均为分析纯试剂，试验用水符合GB/T 6682 中三级用水规定，色谱用水符合GB/T 6682 中一级用水规定，溶液按照GB/T 603 配制。

4.1 三氯甲烷。

4.2 甲醇：色谱纯。

4.3 无水碳酸钠。

4.4 碳酸钠溶液：c=lmol/L，称取无水碳酸钠(4.3)10.6g，加100mL水溶解，摇匀。

4.5 无水硫酸钠。

4.6 硅藻土。

4.7 硅藻土和无水硫酸钠混合物：称取3g硅藻土与20g无水硫酸钠混匀。

4.8 甲萘醌标准品：含量≥96%。

4.9 甲萘醌标准贮备液：称取甲萘醌标准品(4.8)约50mg(精确至0.00001g)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，混匀。该贮备液浓度约为500μg/mL，-18℃保存，有效期一年。

4.10 甲萘醌标准工作液：准确吸取1.00mL甲萘醌标准贮备液(4.9)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，混匀。该工作液浓度约为5μg/mL，-18℃保存，有效期3个月。

5 仪器和设备

5.1 实验室常用仪器设备。

5.2 天平，感量0.001g。

5.3 天平，感量0.0001g。

5.4 天平，感量0.00001g

5.5 旋转振荡器，200r/min。

5.6 离心机：不低于5000r/min(相对离心力为2988g)。

5.7 氮吹仪(或旋转蒸发仪)。

5.8 高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。

6 采样和试样制备

按照GB/T 14699.1 抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。

按照GB/T 20195 制备试样，磨碎，全部通过0.25mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。

7 分析步骤

警示——因维生素K3对空气和紫外光具敏感性，而且所用提取剂三氯甲烷溶液有一定毒性，所以全部操作均应避光并在通风橱内进行。

7.1 试样溶液的制备

称取维生素预混合饲料0.25g~0.5g(精确至0.0001g)或复合预混合饲料1g或浓缩饲料5g(精确至0.001g)、配合 料、精料 充料5g~10g(精确至0.001g)，置入100mL具塞 形瓶中，准确加入50mL三氯甲烷(4.1)放在旋转振荡器(5.5)旋转振荡2min。加5mL碳酸钠溶液(4.4)旋转振荡3min。再加5g硅藻土和无水硫酸钠混合物(4.7)，于旋转振荡器上振荡30min，然后用中速滤纸过滤(或移入离心管，5000r/min离心10min)。

依据样品预期量、称样量和提取液量确定分取量(参见表A.1)，准确吸取适量三氯甲烷提取液(V2)，用氮气吹干(或40℃旋转减压蒸于)。用甲醇(4.2)溶解，定容(V3)，使试样溶液浓度为每毫升含甲萘醌0.1μg~5μg。通过0.45μm有机滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析。

7.2 测定

7.2.1 参考色谱条件

色谱柱：C型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能类似的分析柱；

流动相：甲醇十水(75+25)；

流速：1.0mL/min；

柱温：室温；

进样量：5μL~20μL；

检测波长：251nm。

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